论文摘要：目的：探讨桂枝茯苓丸诱导肿瘤细胞凋亡机制，为桂枝茯苓丸(GFW)开发应用提供实验依据。方法：计算抑瘤率，流式细胞仪测定细胞凋亡率，电镜观察肿瘤细胞超微结构。原位杂交法检测Survivin mRNA表达。结果：GFW抑瘤率为38.93％，流式细胞仪检测GFW组凋亡率17.79％，与模型组比较，差异有统计学意义。GFW组镜下可见瘤细胞以凋亡变化为主。内膜结构完好，核膜清晰，细胞核固缩，染色质团块状散布核内或边集核膜下，并可见凋亡小体。GFW下调肿瘤细胞Survivin mRNA表达，与模型组比较，差异有统计学意义。结论：GFW诱导肿瘤细胞凋亡，其机制可能与下调Survivin mRNA表达密切相关。
论文关键词：桂枝茯苓丸；凋亡；Survivin mRNA
中医认为血瘀是肿瘤的主要成因之一，桂枝茯苓丸是一活血化瘀方剂，广泛用于各种血瘀症的治疗，临床实践证明具一定的抑瘤作用，但对其抑瘤机理的研究并不深入。本文选用荷瘤小鼠作为研究对象，观察桂枝茯苓丸(GFW)对肿瘤细胞的诱导凋亡作用，以其从分子水平上探讨GFW抗肿瘤效应机理，为GFW的临床应用提供理论依据。
1材料与方法
1．1 主要仪器和试剂 原位杂交试剂盒购白天津灏洋生物技术有限公司。OLYMPUS显微镜(日本)、HITACHI－H500型透射电镜(德国菲利蒲公司)、FACSCALIBUR流式细胞仪(美国BD公司)、SB651旋转蒸发仪(日本RIKAKI公司)、HIMAS－2000多媒体彩色病理图文分析系统(同济医大)。
1．2 实验动物 40只昆明小鼠，体重(20±2)g，雄性，由齐齐哈尔医学院实验动物中心提供。
1．3 瘤株S180瘤株，由黑龙江省肿瘤研究所提供
1．4 药物 桂枝茯苓丸：按《金匮要略》记载标准，生药均购自齐齐哈尔市中医院。桂枝、茯苓、桃仁、牡丹皮、赤芍各药等量，加适量水，浸泡2h，先文火后武火煎煮2次，经过滤除渣后，水浴浓缩，配成1g/mL的水煎剂，置4℃保存备用。
环磷酰胺(Cylophosphamide，CY)，山西普德药业有限公司出品，批号H14023686。
1．5 动物模型 取腹腔接种10天的荷瘤小鼠，在无菌条件下抽取腹水(乳白色，黏稠)，放入无菌容器内，置冰块保存。用0.4％台盼蓝生理盐水液计数(计活细胞大于95％)，用生理盐水调细胞浓度至5×106/mL。取KM小鼠30只，每只鼠右侧腋下皮下注射0.2mL瘤细胞悬液。
1．6 动物分组及给药方法 将荷瘤鼠随机分为3组，每组10只，分别为模型组、实验组、CY组，另取10只未荷瘤小鼠作为正常对照。模型组(Model group)：生理盐水灌胃0.2mL/(10g·d)；中药组(GFW group)：GFW灌胃0.2mL/(10g·d)；环磷酰胺组(CY group)：腹腔注射CY20mg/(kg·d)。接种后次日给药，各组每天给药1次，连续10天。
1．7 细胞凋亡的检测(流式细胞仪－单激光单染色法)小鼠脱颈处死，无菌取腋下实体瘤，常规制备瘤细胞悬液，调整浓度1×106/mL，1500r/min离心5min，弃上清，PBS洗1次，加70％冷乙醇1mL,4℃固定30min。离心5min，弃上清，PBS洗2次。加50mg/mL PI染液600mL染色，30min后上机测定。
1．8 透射电镜观察形态学改变 每组随机取2块瘤组织，将瘤组织快速投入2.5％戊二醛固定液固定2h以上，磷酸缓冲液漂洗，1％锇酸后固定1－2h，缓冲液漂洗20min，丙酮梯度脱水，浸透、包埋、制备超薄切片，醛酸双氧铀和柠檬酸铅染色，电镜观察并拍片。
1．9 原位杂交 瘤组织及时固定，切片常规脱蜡至水。3％H2O2室温封闭10min，PBS洗，暴露mRNA核酸片段，滴加预杂交液20μL，40℃3h，不洗，Survivin探针杂交液20μL，滴加40℃杂交过夜，杂交后洗涤，滴加生物素化抗地高辛37℃60min，原位杂交用PBS洗5min×4次，滴加高敏过氧化物酶链亲和索复合物工作液，37℃ 60min，原位杂交用PBS洗5min×4次，DAB显色，苏木素复染，常规酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。本实验设2张阴性对照片，1张用PBS代替探针，1张用PBS代替生物素化抗地高辛。
1．10 统计方法 Survivin结果利用HIMAS－2000多媒体全自动图像分析仪检测，所得数据经SPSS11.0系统处理，采用One Way ANOVA法，两两比较用SNK法。结果用x±s表示。
2 结果
2．1 抑瘤率 与模型组比较，GFW组、CY组瘤重低于模型组瘤重，差异有统计学意义(P＜0.05)。GFW组与CY组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。GFW组抑瘤率为38.93％。
2．2 肿瘤细胞凋亡率 GFW组肿瘤细胞凋亡率为17.79％，与模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。
2．3 肿瘤细胞电镜观察 模型组瘤细胞的核浆比大，双层核膜清晰，核异形性明显，瘤细胞表面可见丰富微绒毛，胞质内线粒体轻度肿胀，核周可见幼稚高尔基复合体及内质网，游离核蛋白体丰富，有少量的淋巴细胞浸润。中药组镜下可见瘤细胞以凋亡变化为主。瘤细胞体积明显变小，细胞表面微绒毛减少甚至消失，内膜结构完好，核膜清晰，细胞核固缩，染色质团块状散布核内或边集核膜下，并可见凋亡小体。游离核蛋白体减少非常明显，线粒体嵴断裂，空泡变性，胞质内可见大量的脂肪堆积；同时可见大量粒细胞侵润并伴有坏死。
2．4 肿瘤细胞中Survivin基因mRNA表达 原位杂交法对Survivin基因mRNA表达进行半定量检测。染色结果Survivin基因表达定位于胞质呈棕黄色，弥漫性分布。在10×40倍高倍镜下，每张标本随机选择5个视野，精确选取视野内所有的阳性颗粒，利用HIMAS－2000多媒体图像分析系统对Survivin各组原位杂交反应阳性细胞面密度值、阳性细胞平均灰度值进行分析。与模型组比较，GFW组与CY组Survivin基因mRNA表达降低(P＜0.01)，GFW组与CY组比较，Survivln基因mRNA表达差异无统计学意义(P＞0.05)。提示GFW可下调肿瘤细胞内凋亡相关基因Survivin mRNA量。
3 讨论
通过应用各种不同的药物影响信号传导途径，从而触发或重建整个死亡程序，使处于关闭状态的凋亡信号传导各效应环节迅速连通，诱导程序化细胞死亡反应，为肿瘤治疗开辟了新思路。细胞凋亡信号传导的大致过程是：细胞整合各种胞内外凋亡信号，通过细胞凋亡信号与其受体形成的复合物经胞浆信号转导蛋白传递至一组细胞凋亡的执行者caspases，再由激活的easpases对其特异性底物进行降解，最终导致细胞凋亡。本实验经流式细胞仪检测表明，GFW可促进荷瘤小鼠体内肿瘤细胞发生凋亡，凋亡率为17.79％。透射电镜观察GFW组瘤细胞以凋亡变化为主。瘤细胞体积明显变小，细胞表面微绒毛减少甚至消失，内膜结构完好，核膜清晰，细胞核固缩，染色质团块状散布核内或边集核膜下，并可见凋亡小体。进一步证明了桂枝茯苓丸的抗肿瘤作用机理和诱导肿瘤细胞凋亡密切相关。
Survivin是lAP(Inhibitor of apoptosls)家族的一个新成员，是目前发现的最强的凋亡抑制因子，广泛表达于各种肿瘤组织。Survlvin可直接作用于Caspase，主要抑制Caspase3和Caspase 7的活性，阻断细胞凋亡。Survivin也可通过F21间接抑制easpase，Survivin与细胞周期调控因子CDK4结合形成Survivin－CDK4复合体使p21从CDK4复合体中释放出来，P21进而与线粒体easpase－3结合，抑制其活性，阻断细胞的凋亡过程。Survivin还可通过促进细胞分裂而抑制细胞凋亡。本实验应用原位分子杂交技术检测Survlvin mRNA，结果显示Survivin mRNA在模型组中高表达，表明在肿瘤细胞中该基因转录功能增强，基因蛋白生成后，通过破坏凋亡平衡参与肿瘤细胞发生发展。与模型组比较，GFW组Survixfin基因mRNA表达降低(P＜0.01)，表明GFW组具有下调凋亡抑制基因Survivin基因mPoNA的转录水平的作用，提示桂枝茯苓丸可通过影响Survivin表达促进肿瘤细胞凋亡，从而抑制肿瘤细胞生长。
综上所述表明GFW具有诱导肿瘤细胞凋亡作用，其分子机制与Survivin表达有关。而肿瘤是多基因异常所致疾病，桂枝茯苓丸抑制肿瘤生长在基因水平的作用是对上述基因特异的作用，或是对多种癌基因和抑癌基因非特异作用有待进一步研究。
《桂枝茯苓丸对荷瘤鼠肿瘤细胞凋亡影响》
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桂枝茯苓丸对荷瘤鼠肿瘤细胞凋亡影响
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