红花中槲皮素的含量测定及氨基酸的成分分析

 

　　关键词：红花；槲皮素；氨基酸；高效液相色谱

 

　　红花原名为红兰花，别名为草红花、刺红花、金红花等。具有活血通经、散瘀止痛、降血压和降血脂的功效，用于治疗痛经、跌打损伤、冠心病、心绞痛和高血压等疾病【1】。其主要的化学成分由黄酮类、有机酸类、烷基二醇类、聚乙炔类、吲哚类化合物，还包括含有查耳酮骨架的色素类成分。药理研究表明，红花能轻度兴奋心脏，降低冠脉阻力，增加冠脉流量和心肌营养性流量【2】。对抗心率失常，抑制血小板聚集，对神经元变性具有强力保护作用。目前红花在临床上已广泛用于预防和治疗冠心病，心肌梗塞，脑血栓等心脑血管疾病【3】。现代药理学实验表明红花中的主要成分槲皮素与一些氨基酸在抗凝血和抗脑缺血方面都具有很好活性【4】。目前，许多国家都在致力于天然药物的研究、开发和利用，我国的传统中药不仅在与国外天然药物的竞争中传统优势地位受到冲击，而且中药在国内市场的生存空间也受到了挑战【5】。为了使我国的传统中药能成功应对国外医药产业的挑战，就必须依靠现代科学技术的方法和手段。本文为此具体详细探讨了红花中槲皮素的含量测定及氨基酸的成分分析，现报告如下。

 

　　1 仪器与试剂

 

　　红花药材：2011年2月购自四川峨嵋基地，由药物所生药室鉴定。采收季节为七月。经成都中医药大学鉴定教研室鉴定，均符合《中国药典》2000版规定。11OO高效液相色谱仪(G1310A IsoPump)， 配套有chemstation数据处理软件的紫外检测器梅特勒-托利多AE240电子天平， 上海生工超声波清洗器(中国)。甲醇为色谱纯(天津)，水为重蒸馏水(自制)，其它试剂均为分析纯。槲皮素对照品：中国药品生物制品检定所提供(批号：20090584)，供含量测定用。

 

　　2 红花中槲皮素的含量测定

 

　　2.1 色谱条件

 

　　色谱柱：ZorbaxSBC18(5μm，150mm×4.6mm)：流动相：甲醇-O.4%磷酸(50：50)：检测波长：370nm：柱温：30℃；流速：1.0ml/min。

 

　　2.2 对照品溶液的制备

 

　　精密称取干燥至恒重的槲皮素对照品约1Omg，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。

 

　　2.3 供试品溶液的制备

 

　　准确称取红花药材O.500g置锥形瓶中，加入50%甲醇水溶液40 mL，常规超声提取30 分钟，移入50 mL量瓶并定容。摇匀后静置10分钟，吸取上清液经O.45gm的微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

 

　　2.3 标准曲线的制备

 

　　精密吸取槲皮素对照品溶液0.10，O.50，1.00，5.00，1O.0μg·mL-1注入液相色谱仪，记录色谱图，测定其峰面积，并以峰面积值(A)对进样量(C)进行回归，得标准曲线方程为：y=403.4x-12.2552，F=0.9992。以峰面积值(A)对进样量(C)作图，得一直线，结果表明进样量在O.214μg·mL-1～2.14μg·mL-1范围内，槲皮素线性关系良好。具体见图1。

 

　　图1：高效液相色谱图，“1”为槲皮素峰值

 

　　2.4 精密度试验

 

　　精密吸取样品供试品溶液10ul注入液相色谱仪，重复进样3次，测得槲皮素峰面积的相对标准偏差RSD(%)为1.11%，表明其精密度良好。结果见表1。

 

　　表1：精密度试验结果

 

　　2.5 稳定性试验

 

　　取样品供试品溶液分别于O、4、8小时分别进样，结果测得槲皮素峰面积变化不大，相对标准偏差RSD(%)为1.95%，表明样品供试液在8小时内稳定。结果见表2。

 

　　表2：稳定性试验结果

 

　　2.6 回收率试验

 

　　取已知含量的样品3份，分别精密添加一定量的槲皮素对照品溶液，按上述供试品溶液制备方法制备加样回收供试品溶液，精密吸取适量供试品溶液，注入液相色谱仪，加样回收率测得的结果均在95%-105%之间， 得到平均回收率为98.5%，RSD(%)为2.42%。结果见表3。

 

　　表3：加样回收率试验

 

　　2.7 含量测定

 

　　按拟定的含量测定方法，制样品供试品溶液。精密吸取适量对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，测定含量平均为0.49mg/g。

 

　　3 红花中氨基酸的成分分析

 

　　红花干燥药材4.8kg，用甲醇40L室温浸泡48小时，提取三次，减压回收甲醇，得干浸膏，加少量的水混悬，依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别减压浓缩干燥得相应部位。将石油醚层部位经反复硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯以及氯仿-甲醇溶剂系统洗脱，并用Sephadex LH-20纯化。将氯仿层部位经反复硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯以及氯仿-甲醇溶剂系统洗脱，并用Sephadex LH-20纯化。将乙酸乙酯层部位经反复硅胶柱层析，以氯仿-甲醇溶剂系统洗脱，并用Sephadex LH-20纯化。

 

　　结果显示红花中含有16 -19种氨基酸。其中人体必需氨基酸7-8种，即亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、苏氨酸、组氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸。从含量上看，谷氨酸的含量5%最高，其次是天冬氨酸、精氨酸，含量最低的是蛋氨酸，缬氨酸、赖氨酸的含量中。

 

　　4 讨论

 

　　红花分为有刺和无刺两种，原栽培多为有刺者，但在红花生长过程中有的锐剌退化成小刺、有的锐刺变成圆秃或无刺，收集无刺红花的种子进行栽培，目前多栽培无刺红花。据报道，有刺红花开花早，花期长，采收期长，干花产量低；子实量高，予实性状好【6】。无刺红花开花迟，花期短，采收期短，鲜花产量低，折干率高，干花产量大：子实量小，子实性状差，无刺红花的红色素含量较高。据以上情况，有刺红花适于作油料，无刺红花适合药用【7】。

 

　　在药物学上，红花始载于《开宝本草》，列为中品。《唐本草》日：红花“治口噤不语，血结，产后诸疾。”《本草蒙荃》谓：红花治“喉痹噎塞不通，捣汁咽。”《本草纲目》称红花能“活血、润燥、止痛、散肿通经。”《本草再新》记载红花功效为“利水消肿，安生胎，堕死胎。” 【8】红花的化学成分比较复杂，主要富含黄色素和红色素，另含脂肪油俗称红花油，是棕榈酸、花生酸、亚油酸、油酸、硬脂酸等甘油脂类。自上世纪初就

 

　　有人开始研究其化学成分，先后分得黄酮类、聚乙炔类、吲哚类、甾体类、木脂索类、烷基二醇类、有机酸类及甾醇类及红花的主要色素成分两百七十余种【9】。

 

　　在药理作用中，有研究用红花注射液治疗冠心病患者60例，使用后观察血沉、血沉方程值、红细胞电泳、红细胞压积、全血黏度、全血还原黏度、血浆黏度、体外形成血栓长度、质量等数据，均有所下降，且有显着性差异。血小板黏附率，纤维蛋白下降非常明显(P<O.O1)。使用后，大部分患者心绞痛发作次数有所减少，总有效率为76.7%。兔主动脉条片实验分析表明，红花注射液对血管作用的整体实验中红花注射液可使麻醉犬股动脉血流轻度增加【10】。并降低外周血管阻力，说明红花有较弱的血管扩张作用。实验研究表明，红花黄色素能非常明显地抑制ADP诱导的家兔血小板聚集及显着的解聚作用，O.22g/ml的红花黄色素其聚集抑制率和聚集率分别达到85.9%和78.9%。红花黄色素对大鼠实验性血栓形成也有极显着的抑制效应，抑制率为73.4%。实验用小鼠给红花黄色素30分钟后，将小鼠分别放入容积相等的仓内，密闭减压，观察60分钟，结果与对照组比较，存活率15：1O，给药组延长存活时间168.72%【11】。实验表明，红花黄色素可显着延长小鼠对减压缺氧的存活时间，但对存活率提高不明显。红花的水提取物及醇提取物均有较好的抗炎作用，据报道，红花50%甲醇提取物及水提取物能抑制角叉菜胶所致的动物足肿胀，说明红花提取物有抗炎作用。红花黄色素对甲醛性足肿胀有明显的抑制作用，对由组胺引起的大鼠皮肤毛细管的通透量增加有明显的抑制作用，对大鼠棉球肉芽肿形成有显着抑制作用【12】。

 

　　红花主要成 含红花甙（carthamin）、新红花甙（neocarthamin）、红花醌甙（carthamone）、红花多糖、棕榈酸、肉桂酸、月桂酸。槲皮素又名栎精，槲皮黄素，溶于冰醋酸，碱性水溶液呈黄色，几乎不溶于水，乙醇溶液味很苦。可作为药品，具有较好的祛痰、止咳作用，并有一定的平喘作用。此外还有降低血压、增强毛细血管抵抗力、减少毛细血管脆性、降血脂、扩张冠状动脉，增加冠脉血流量等作用。槲皮素不溶于水，故导入亲水性基团增加溶解性，便于吸收，从而增强其药理作用。合成的槲皮素氧乙酸赖氨酸盐，水溶性增加。本文结果显示，红花中槲皮素含量平均为0.49mg/g，高效液相色谱法测定在370nm有最大吸收波长，测定精密度与稳定性比较好。从含量上看，谷氨酸的含量5%最高，其次是天冬氨酸、精氨酸，含量最低的是蛋氨酸，缬氨酸、赖氨酸的含量中。

 

　　总之，高效液相色谱法测定红花中槲皮素具有准确率高、回收率与精密度好等特点，可推广成为中药样品的测定含量方法。而红花中含有多种氨基酸，可提取应用。

 

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　　[6] 朴永哲，金鸡．红花黄色素改善大鼠缺氧心肌能量代谢的研究[J]．中草药，2010，34(5)：436-439．

 

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　　[10] 藏宝霞，金鸡．羟基红花黄色素A对血小板活化因子的拮抗作用[J]．药学学报，2010，37(2)：696-699．

 

　　[11] 陈文梅，金鸣．红花黄酮成分抑制血小板激活因子介导的血小板活化作用[J]．药学学报，2011，30(12)：881-885．

 

　　[12] Chu HW，Wu HT，Lee YJ．RegioselectiVe hydroxylation of 2-hydroxy chalcones by dimethyldioxirane towards polymemoxylated flaVonoids[J]．Tetrahedron，2009，60(11)：2647-2655．