应用生态学报投稿一株高产纤维素酶菌的筛选及发酵条件优化

来源：职称驿站所属分类：环境科学论文
发布时间：浏览：44次

　　摘要：采用羧甲基纤维素钠(CMC)-刚果红平板法，对富含腐烂玉米秸秆的土样进行纤维素酶产生菌的筛选及目标菌株发酵培养条件的优化试验。结果表明，筛选分离出10株产纤维素酶菌株，其中有3株菌株产酶效果较好，特别是菌株tg31对玉米秸秆水解率高达37.62%，其最佳发酵工艺的温度为28 ℃，发酵初始pH 5.0，接种量6%，摇瓶转速180 r/min，经5 L罐放大试验，得出在120 h时其滤纸酶活力(FPA)可达到14.21 IU/mL。

　　关键词：应用生态学报,纤维素酶,菌株,发酵,玉米秸秆,水解

　　Optimizing Conditions of Screening and Fermentation for a Strain of High-yield Cellulase

　　CHAI Ming-yan

　　(Pharmaceutical and Biological Engineering Department of Zibo Vocational Institute， Zibo 255314， Shandong， China)

　　Abstract： To obtain the high-yield cellulase strain， the sodium carboxymethyl cellulose (CMC)-congored plate method was used to screen cellulase-producing bacteria in soil samples riched with corn stalk fiber. Fermentation conditions were optimized also determined. The results showed that 10 cellulase-producing bacterial strains were isolated. Among these strains， three bacterial strains had the best effects on producing the celluloses. Especially， the strain tg31 could hydrolyze corn straw at a rate up to 37.62%. The optimal fermentation conditions were temperature of 28 ℃， initial fermentation with pH 5.0， 6% inoculation and shaking speed of 180 r/min. Under the optimal condition， the strain was amplified with 5 L tank and enzyme activity reached 14.21 IU/mL at 120 h. The strain Tg31 obtained the best FPA activity with significant hydrolysis rate of corn stalk， indicating that it had the abroad prospect of application.

　　Key words： cellulase; strain; fermentation; corn stalk; hydrolysis

　　中国是农业大国，每年产生的农作物秸秆总量超过7亿t，约占世界秸秆总产量的1/3[1，2]，其中玉米秸秆产量高达2.2亿t[3]。玉米秸秆的主要成分是纤维素、半纤维素和木质素等，难以被人类有效利用。目前，中国玉米秸秆大部分被直接焚烧，不仅对环境造成了极大的污染，同时也浪费了大量的秸秆纤维素资源[4]。为改变现状，开发纤维素酶降解玉米秸秆，实现废弃资源的生物利用，已逐渐成为该领域的研究热点之一。纤维素酶可充分降解秸秆中的纤维素，将其转化为微生物可利用的糖类，大大提高玉米秸秆的经济利用价值，该技术在医药中间体、精细化工、食品、饲料及生物能源等领域都有广泛的应用前景[5，6]。因此，展开高产纤维素酶菌株的选育、发酵工艺条件优化等研究工作，对纤维素的商业化开发具有重大意义。

　　本研究在玉米秸秆地进行针对性的取样筛选，获得一株高产、高玉米秸秆水解率的菌株，并对其产酶条件进行了摇瓶优化及5 L罐发酵工艺放大，为玉米秸秆纤维素资源的产业化应用打下基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 样品采集从辽宁省喀左县富含腐烂玉米秸秆地区取土样若干。

　　1.1.2 培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)的配制参照邱雁临等[7]的配方。初筛培养基：羧甲基纤维素钠(CMC-Na)2.0 g，琼脂2.2 g，土豆汁20 g，蔗糖2.0 g，去离子水 100 mL;复筛培养基：CMC-Na 2.0 g，琼脂2.2 g，土豆汁20 g，蔗糖2.0 g，刚果红0.02%，去离子水100 mL;发酵培养基：蛋白胨1.0 g，酵母粉1.0 g，CMC-Na 1.0 g，NaCl 0.5 g，KH2PO4 0.1 g，去离子水100 mL，pH 7.0。

　　1.2 方法

　　1.2.1 菌株初筛：参照肖舸等[8]的方法稍加改动，称取0.5 g 样品加入49.5 mL含有玻璃珠的生理盐水中(稀释度为10-2)，振荡30 min混匀，并将上清液按10-3、10-4、10-5稀释，各取1 mL稀释液接种于分离培养基平板上，每个稀释度进行两次重复，28 ℃培养48 h，挑取生长较快的菌株纯化两次，镜检后接种到斜面上，4 ℃保存。复筛：使用打孔器将纯化后的菌株挑取单菌落放置到CMC-刚果红平板上，28 ℃培养3 d，测量透明圈的大小，透明圈大说明纤维素酶的分泌能力强[9]。　　1.2.2 摇瓶发酵优化研究摇瓶发酵温度、pH、接种量及转速对菌株产酶效果的影响，以期获得最适的产酶工艺。用250 mL三角瓶将筛选得到的水解圈较大的菌株接种于30 mL液体发酵培养基中发酵培养。其中，温度设计：24、26、28、30、32 ℃;初始pH设计：3、4、5、6、7、8;接种量设计：2%、4%、6%、8%、10%;摇瓶转速设计：120、150、180、210、240 r/min。发酵5 d后取样测酶活性，每个研究条件均设置2个平行样。

　　1.2.3 滤纸(FPA)酶活测定依据刘德海等[10]的研究，将发酵液5 000 r/min离心10 min，收集上清液，将0.5 mL发酵液上清液和1 mL 0.05 mol/L pH 4.8柠檬酸缓冲液加入试管，加热至50 ℃，加入whatman滤纸[(50±1 mg)]，反应60 min，立即加入3，5-二硝基水杨酸(DNS)反应液3 mL，水浴5 min。冷却至室温，用去离子水适当稀释，在540 nm处测定吸光度。滤纸酶活定义为每分钟转化生产1 μmol葡萄糖所需的酶量为1 IU。

　　1.2.4 水解试验参照文献[11]，采用酶液进行水解试验，水解体系为30 mL，反应温度为50 ℃，底物浓度10%，pH 4.8的柠檬酸缓冲液为缓冲体系，酶的装载量根据底物量定为10 IU/g。分别对玉米芯、玉米秸秆、木屑、蔗糖渣与棉子壳进行水解试验。

　　1.2.5 5 L发酵罐放大将摇瓶获得的最佳发酵工艺条件进行5 L发酵罐放大试验，发酵开始24 h第一次取样，以后每隔12 h进行一次取样，共发酵120 h。

　　2 结果与分析

　　2.1 产纤维素酶菌株的分离筛选

　　采用刚果红染色法从富含腐烂玉米秸秆的土样中筛选获得菌圈较大的10株菌株，菌株编号及透明菌圈直径如表1所示。jx25、lt01及tg31产纤维素酶能力最强，选取此3株菌株进行发酵工艺优化试验。

　　2.2 摇瓶发酵结果

　　2.2.1 最佳温度试验考察不同温度水平对3株菌株摇瓶发酵产酶效果的影响，经发酵液测得FPA酶活。由图1可见，jx25与tg31最适发酵温度均为28 ℃，lt01最适温度为30 ℃。其中tg31菌株酶活最高为5.89 IU/mL，其次jx 25酶活为4.72 IU/mL，lt 01酶活仅为4.42 IU/mL。

　　2.2.2 最适初始pH 由图2可见，随着初始pH的增加jx25、lt01和tg31产酶能力逐渐提高，在pH 5.0时均达到最高，分别为6.234、6.824与7.350 IU/mL，而后酶活随pH增加逐渐降低，当pH 为8.0时酶活最低。由此可见，选用初始pH 5.0作为3株菌株摇瓶发酵pH最为适宜。

　　2.2.3 最适接种量由图3可见，接种量为6%时，3株菌株的FPA酶活均达到最高，其中tg31酶活最高，达到9.56 IU/mL，是jx25酶活(7.92 IU/mL)的1.2倍。故菌株最适接种量为6%。

　　2.2.4 最佳摇瓶转速由图4可见，随着转速的提高，初始阶段酶活也随之提高，当转速为180 r/min时，3株菌株酶活均达到最高，jx25、lt01、tg31分别为9.83、10.49、13.68 IU/mL，而后随着转速增加酶活降低。可见，最佳摇瓶转速为180 r/min。

　　2.3 纤维素酶对不同底物的水解

　　3株菌株发酵获得的发酵液对不同底物的水解效率如图5所示。由图5可见，jx25对甘蔗渣和木屑的水解效率最高，分别达到18.23%和27.46%;水解底物为棉子壳、玉米秸秆、玉米芯时，tg31水解效率最好，分别为27.38%、37.62%、27.86%。由此可知tg31是能产生针对玉米类秸秆纤维素高效高产降解酶的菌株，鉴于中国废弃玉米秸秆量巨大的现状，tg31具有广阔的应用前景。

　　2.4 5 L发酵罐放大

　　综合摇瓶发酵结果，tg31菌株FPA酶活最高，水解试验得知其对玉米秸秆的水解效果最好，是一株能产生针对玉米类秸秆纤维素高效高产降解酶的菌株，故选择tg 31进行5 L发酵罐放大。5 L发酵罐不同时间酶活曲线如图6所示。由图6可见，5 L发酵罐中，接种后酶活迅速提高，发酵前96 h提升速率较快，96～120 h时酶活提升速率减缓，120 h时酶活最高，达到14.2 IU/mL。

　　3 小结和讨论

　　运用透明圈法和摇瓶液体培养法，对从富含腐烂玉米秸秆的土壤样品中得到的纤维素酶高产菌进行初筛和复筛，获得一株高酶活、高产纤维素酶的菌株tg31，将其作为液体发酵条件研究的供试菌种。对该菌的产酶条件(包括最适温度、最适pH、最适接种量和最佳转速)进行研究得出摇瓶发酵产酶最优工艺条件为发酵温度30 ℃，发酵初始pH 5.0，最适接种量6%，最佳转速180 r/min，此时酶活达到13.68 IU/mL，对玉米秸秆水解率达到37.62%，并可将此工艺成功放大应用于5 L发酵罐中。

　　纤维素作为世界上最丰富的可再生资源，其生物利用潜力备受人们的关注。据研究得出，酶学降解产生单糖或蛋白质等产品是纤维素生物利用的最佳途径，其有关研究已成为生物科学的热点领域。目前，随着科学研究的不断深入，纤维素酶的应用技术逐渐成熟。玉米秸秆作为丰富的可再生资源，含有大量纤维素和半纤维素成分，难以被生物有效降解。经过纤维素酶等酶系的有效降解，能够产生更高的经济价值。为此，利用纤维素酶降解玉米秸秆的研究具有重要的科学意义。

　　目前，有关纤维素酶及其产酶菌的研究已有大量报道，并取得了一定的进展，主要集中在以下几个方面：一是产纤维素酶微生物的筛选。已知自然界中能分解纤维素的微生物主要为真菌及部分细菌，其中以木霉、青霉及曲霉的降解能力最为突出[12，13];二是影响纤维素酶菌株在发酵罐中放大培养的因素，如溶氧[14]、传质[15]及起泡沫[16]等;三是产纤维素酶菌株的发酵方式，如补料及分批发酵[17]等。　　本研究从富含腐烂玉米秸秆的土样中获得高产纤维素酶菌株tg31，依据发酵条件优化的初步结果发现，tg31具有良好的产纤维素酶特性，具有广阔的应用前景。结合国内外研究进展，有关tg31的后续研究，应着重考虑结合流体力学及数学模型进行有效的发酵工艺优化。

　　参考文献：

　　[1] 韩鲁佳，闫巧娟，刘向阳，等.中国农作物秸秆资源及其利用现状[J].农业工程学报，2003，19(3)：87-91.

　　[2] 陈小华，朱洪光.农作物秸秆产沼气研究进展与展望[J].农业工程学报，2007，23(3)：279-283.

　　[3] 张源泉，孙风英，关凤梅，等.玉米秸秆稀硫酸预处理条件的初步研究[J].纤维素科学与技术，2002，10(2)：32-36.

　　[4] 王双，许洁，李浠源，等.秸秆纤维素降解细菌的筛选及产酶条件优化[J].湖北农业科学，2013，52(5)：1121-1124.

　　[5] BHAT M K，BHAT S. Cellulase degrading enzymes and their potential industrial applications[J]. Biotechnology Advances，1997， 15(3-4)：583-620.

　　[6] 史央，蒋爱，戴传超，等.秸秆降解的微生物学机理研究及应用进展[J].微生物学杂志，2002，22(1)：47-51.

　　[7] 邱雁临，孙宪迅，蔡俊，等.纤维素酶耐高温高产菌株的选育[J].中国酿造，2004(2)：15-19.

　　[8] 肖舸，雷芳，喻东，等.一株产纤维素酶绿色木霉的筛选及发酵条件优化[J].四川大学学报(自然科学版)，2004，41(2)：422-425.

　　[9] 李一婧，马伟超，王媛.纤维素酶高产菌的分离纯化与产酶工艺优化[J].湖北农业科学，2012，51(8)：1660-1662.

　　[10] 刘德海，杨玉华，安明理，等.纤维素酶酶活的测定方法[J].中国饲料，2002(17)：27-28.

　　[11] 李梦雪，张志军，孙子文，等.紫苏秸秆纤维素酶水解工艺优化研究[J].食品工业科技，2013，34(15)：193-195.