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来源：职称驿站所属分类：环境科学论文 发布时间：2015-01-26浏览：18次
摘要：采用平板覆盖玻璃纸培养法，初步探讨了甘露醇、二甲基亚砜(DMSO)、苯甲酸钠和N，N-二甲基对亚硝基苯胺等4种羟基自由基清除剂， L-半胱氨酸、还原型谷胱甘肽和β-巯基乙醇等3种巯基化合物和抗坏血酸对粗柄羊肚菌(Morchella crassipes)菌丝生长和菌核发生的影响。结果表明，作为可以降低真菌胞内氧化应激的活性氧自由基清除剂，测试药剂对菌丝生长和菌核发生具有抑制作用，且该抑制作用随着药剂浓度的增加而增强，较高浓度的添加药剂可完全抑制菌核发生。随着测试药剂的羟基自由基清除能力增强，完全抑制粗柄羊肚菌菌核发生的浓度相应降低，菌丝生长也大致表现出类似的趋势。测试的较强自由基清除剂苯甲酸钠、N，N-二甲基对亚硝基苯胺、3种巯基化合物和抗坏血酸改变了粗柄羊肚菌菌落的色泽，表明打破了粗柄羊肚菌正常的生理活动。
关键词：《福建农业》编辑部,粗柄羊肚菌(Morchella crassipes),自由基清除剂,氧化应激,菌丝生长,菌核发生
Effects of Oxidative Stress on Mycelial Growth and Sclerotial Metamorphosis
of Morchella crassipes
HE Pei-xin1，LIU Wei2，CAI Ying-li3，MA Ben-jun1，CHEN Lei-tao1，WU Xiao-rui1
( 1. School of Food and Biological Engineering， Zhengzhou University of Light Industry， Zhengzhou 450002，China;
2. Institute of Hydrobiology， Chinese Academy of Sciences， Wuhan 430072， China;
3. Institute of Applied Mycology， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China)
Abstract：Cellophane-cover plating method was used to study the influences of radical scavengers on mycelial growth and sclerotial metamorphosis of Morchella crassipes. Five hydroxyl radical scavengers (mannitol， DMSO， sodium benzoate and N，N-dimethyl nitrosoaniline)， three mercapto compounds (L-cysteine， glutathione and β-mercaptoethanol) and ascorbic acid were tested. Results showed that the reactive oxygen radical scavengers could reduce fungal intracellular oxidative stress. The chemical agents tested inhibited the mycelial growth and sclerotia occurrence. The inhibition was enhanced with the increase of tested agents. Drugs with high concentrations inhibited completely the occurrence of sclerotia. With the enhancement of hydroxyl radical scavenging capacity， the concentration of scavengers completely inhibited occurrence of the sclerotia reduced accordingly. The effects on mycelial growth were similar. It is indicated that strong free radical scavengers such as sodium benzoate， N，N-dimethyl nitrosoaniline， mercapto compounds and ascorbic acid changed the color of colonies of M. crassipes， indicating the normal physiological activity was interrupted.
Key words： Morchella crassipes; radical scavenger; oxidative stress; mycelial growth; sclerotial metamorphosis
氧化应激(Oxidative stress)是指细胞内氧化增强剂与抗氧化剂之间的平衡向氧化增强的方向变化，高活性分子如活性氧(Reactive oxygen species，ROS)产生过多，超过了细胞的抗氧化能力，造成个体或细胞的氧化损伤[1]。在真菌中，氧化应激会导致DNA、蛋白质和脂肪大分子氧化损伤，诱导细胞循环改变、细胞凋亡和分化的发生。氧化应激会诱导齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)等多种真菌菌核分化，通过形成菌核规避氧气，阻止超氧化状态的发展，避免对细胞产生更大的损伤[2]。 羊肚菌(Morchella spp.)是一类世界性分布的名贵大型真菌，具有较大的食用和药用价值。百余年来，国内外对羊肚菌的分类鉴定、自然分布、生理生态、遗传特性和人工栽培等进行了大量研究。然而，羊肚菌的人工栽培至今仍未得到根本上的解决[3，4]。菌核是多种羊肚菌生活史的必经阶段，诱导形成菌核是其人工栽培的基础[5-7]。关于羊肚菌菌核发生生理学的研究报道较少，没有发现氧化应激影响羊肚菌菌核发生的系统研究报道。为此，采用平板覆盖玻璃纸法，初步探讨了甘露醇、二甲基亚砜(DMSO)、苯甲酸钠和N，N-二甲基对亚硝基苯胺等4种羟基自由基清除剂，谷胱甘肽(还原型)、L-半胱氨酸和β-巯基乙醇等3种巯基化合物和维生素族抗氧化剂――抗坏血酸对粗柄羊肚菌(M.crassipes)菌丝生长和菌核发生的影响，以期为深入开展氧化应激影响羊肚菌菌核发育的生理学机制研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 供试材料
供试粗柄羊肚菌菌株组织分离自河南省郑州市郊区发生的子囊果，经过形态学和分子生物学分析确定其分类地位[8]。
CYM完全培养基：蛋白胨2 g，酵母膏2 g，硫酸镁0.5 g，磷酸二氢钾0.46 g，磷酸氢二钾1 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水定容至1 000 mL，121 ℃灭菌25 min。
1.2 试验方法
测定了甘露醇(0、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 mol/L)、DMSO(0、20、40、100、150、300 mmol/L)、苯甲酸钠(0、2、6、10、15、20 mmol/L)、N，N-二甲基对亚硝基苯胺(0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mmol/L)等4种羟基自由基清除剂，β-巯基乙醇(0、2、4、6、12、24 mmol/L)、L-半胱氨酸(0、1、5、10、20、40、80 mmol/L)和谷胱甘肽(还原型)(0、1、5、10、20、40、80 mmol/L)等3种巯基化合物以及抗坏血酸(0、30、60、90、120、150 mmol/L)对供试菌株菌丝生长和菌核发生的影响。所有化学试剂均为国产分析纯，采用0.22 μm的细菌过滤器过滤除菌。采用直径9 cm的玻璃培养皿培养、试验。玻璃纸裁成圆形，直径略小于9 cm，用10 mmol/L的EDTA-Na2水溶液煮沸 10 min，再用去离子水洗涤2次，121 ℃高压蒸汽灭菌、备用。供试药物过滤除菌后，待培养基冷却至约50 ℃时，与培养基混匀、倒平皿，待培养基凝固后覆盖玻璃纸。用打孔器打取直径5 mm的菌丝块接种于玻璃纸中间，24 ℃恒温培养。接种块菌丝的菌龄、厚度和大小保持一致。每天观测并记录菌落直径(mm)和菌株生长发育状态，按下式计算菌丝生长速度：菌丝生长速度(mm/h)=(菌落直径-5)/(培养时间×2)。连续培养14 d，统计菌核数量，测量菌核大小(mm);揭下含有菌丝体和菌核的玻璃纸，用镊子将菌核小心取出，50 ℃烘干至恒重，称重(mg);将剩余的菌丝刮下、烘干、称重。每处理3次重复。
1.3 数据分析与处理
采用SPSS 17.0软件分析和处理数据。所有分析的数据为3个重复的平均值±标准差(SD)。
2 结果与分析
2.1 羟基自由基清除剂对粗柄羊肚菌菌丝生长和菌核发生的影响
从图1可以看出，甘露醇对粗柄羊肚菌菌丝生长的影响较小。低浓度(≤0.10 mol/L)时不影响菌丝生长，较高浓度则产生轻微的抑制作用。添加浓度达0.80 mol/L时，菌丝生长速度较对照组低10%左右。甘露醇整体上抑制菌核发育，其抑制效果随着药剂浓度的升高而增强，≥0.40 mol/L时完全抑制菌核的发生。此外，在给定的浓度条件下，甘露醇不影响粗柄羊肚菌菌落的色泽。
从图2可以看出，DMSO对粗柄羊肚菌菌丝生长和菌核发生的影响强于甘露醇。低浓度(20 mmol/L)的DMSO，菌丝的生长速度和对照组相当;随着浓度的持续升高，菌丝生长速度平缓降低;最高浓度(300 mmol/L)条件下也没有完全抑制菌丝体的生长。随着DMSO浓度的增加，对菌核发生的抑制作用增强;浓度≥150 mmol/L时完全抑制菌核的发生。在测试的药剂浓度下，没有影响粗柄羊肚菌菌落的颜色。
从图3可以看出，苯甲酸钠对粗柄羊肚菌菌丝生长和菌核发生产生了较强的影响。随着药剂浓度的增加，对菌丝生长的抑制作用增强。15 mmol/L的条件下，24 ℃恒温培养14 d，菌落未能长满平板，菌落边缘不整齐; 20 mmol/L时则完全抑制菌丝体的生长，表现为强抑制作用。浓度2 mmol/L苯甲酸钠的平板有少量菌核的发生，菌核总重量为10.2 mg;浓度≥6 mmol/L以上时完全抑制菌核的发生。随着苯甲酸钠浓度的增加，菌落的颜色逐渐加深。15 mmol/L条件下，菌落颜色为深棕色。
从图4可以看出，N，N-二甲基对亚硝基苯胺对粗柄羊肚菌菌丝生长和菌核发生的抑制作用最强。随着药剂浓度的升高，菌丝生长速度逐渐下降，菌核数量和总重量逐渐降低。1.5 mmol/L时完全抑制菌核的发生。菌落的颜色随着药剂浓度的升高逐渐变浅，浓度1.2 mmol/L下为浅棕色，浓度1.5 mmol/L下为黄白色。
2.2 巯基化合物对粗柄羊肚菌菌丝生长和菌核发生的影响
从图5可以看出，谷胱甘肽(还原型)和L-半胱氨酸对粗柄羊肚菌菌丝生长和菌核发生产生了相似的影响。添加药剂的浓度为1 mmol/L不影响菌丝的生长，但菌核发生比对照组显著减少;药剂浓度升高，对菌丝生长和菌核发生产生了显著影响，浓度≥10 mmol/L时完全抑制菌核发生。通过药物处理后的菌落形态和菌核发育状况可以看出，谷胱甘肽(还原型)对菌丝生长的抑制作用强于L-半胱氨酸，浓度≥10 mmol/L时，24 ℃恒温培养14 d，添加谷胱甘肽(还原型)菌丝难以长满平板，菌落边缘不整齐，菌落的颜色逐渐变浅，最终表现为白色菌落;而添加L-半胱氨酸，菌丝缓慢生长，最终可发满平板，但菌丝生物量明显降低，菌落颜色随着药剂浓度增高而逐渐变浅，最终为浅棕色至淡黄色。 从图6可以看出，CYM平板中不同浓度的β-巯基乙醇表现出对粗柄羊肚菌菌丝生长和菌核发生产生较强的抑制作用。2 mmol/L时菌丝以较低的速度(0.02 mm/h)生长;持续培养14 d，菌丝可长满平板，菌落浅棕色，气生菌丝较少。4 mmol/L时强烈抑制菌丝生长，持续培养14 d菌丝未能长满平板，菌落边缘不整齐。浓度大于4 mmol/L则完全抑制菌丝生长。所有添加药剂的平板均没有菌核发生，表现为对菌核的强烈抑制作用。
2.3 抗坏血酸对粗柄羊肚菌菌丝生长和菌核发生的影响
试验结果表明，随着添加药剂浓度的增加，抗坏血酸对粗柄羊肚菌菌丝生长的抑制作用增强。浓度为30 mmol/L时，菌丝生长速度(0.07 mm/h)明显低于对照(0.33 mm/h);浓度大于120 mmol/L时则完全抑制菌丝生长，表现出对菌丝生长的毒害作用。添加药剂的平板菌落颜色为浅黄色至乳白色，边缘不整齐。所有试验浓度下平板均没有菌核发生。
3 小结与讨论
按照反应速率常数，测试的4种羟基自由基清除药剂可分为3种类型：甘露醇为弱清除剂，DMSO和苯甲酸钠为中等清除剂，N，N-二甲基对亚硝基苯胺为强清除剂。N，N-二甲基对亚硝基苯胺通过苯胺环的羟基化清除羟基自由基，清除速率较高;DMSO与羟基自由基反应产生甲基自由基、烷类、甲烷磺酸、甲醛等多种产物;苯甲酸盐通过其苯甲酸酯环的羟基化或脱羧作用清除羟基自由基;甘露醇为传统的羟基自由基清除剂，通过形成羟基过氧化氢自由基发挥作用[9]。本研究表明，随着测试药剂的羟基自由基清除能力增强，完全抑制粗柄羊肚菌菌核发生的浓度相应降低，菌丝生长也表现出类似的趋势。羟基自由基清除剂对粗柄羊肚菌菌核发生的影响，与氧化应激诱导真菌菌核发生的假说[2]相一致。该假说已经在齐整小核菌、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、小核盘菌(S. minor)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)等产菌核的植物病原真菌上得到验证[10，11]。随着药剂自由基清除能力和浓度的增加，对自由基的清除程度加大，降低了胞内氧化应激水平，抑制了菌核的发生。相比而言，DMSO完全抑制粗柄羊肚菌菌核发生及明显抑制菌丝生长的添加浓度(分别为150 mmol/L和大于300 mmol/L)远高于自由基清除反应速率常数相近的苯甲酸钠(分别为6 和15 mmol/L)，原因可能是DMSO较难通过真菌的细胞膜，被完全吸收发挥作用的能力更低。类似的结果也见于齐整小核菌等植物病原真菌研究[10，11]。
巯基氧化还原态(Thiol redox state，TRS)是很多主要的生物学过程，特别是氧化应激的必需代谢效应物[12]。还原态(游离巯基)和氧化态(形成二硫键)的TRS成分分别是氧化应激低与高的指示剂。L-半胱氨酸含有游离巯基基团，对维持多数抗氧化酶的活性具有重要作用。谷胱甘肽(还原型)是重要抗氧化酶谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的底物。GPX利用谷胱甘肽催化过氧化氢生成水，或使有机氢过氧化物(ROOH)还原为ROH。β-巯基乙醇是潜在的还原分子、抗氧化剂和膜稳定剂。这些巯基化合物均可直接或间接清除自由基，降低氧化应激[9]。本研究表明，测试的3种巯基化合物对粗柄羊肚菌菌丝生长和菌核发生产生了较强的抑制作用，随着添加浓度的增加，更显著降低了氧化应激，对菌核发生的抑制作用也加强。该结果与齐整小核菌等植物病原真菌的结果一致[13-15]，也符合氧化应激诱导真菌菌核发生的假说[2]。
抗坏血酸是维生素族水溶性抗氧化剂，可清除多数ROS，如过氧化氢自由基、超氧化物自由基、羟基自由基和单态氧;还能充当脂质抗氧化剂及间接脂质抗氧化剂，恢复维生素E的脂质抗氧化剂性质[9]。本研究表明，一定浓度的外源抗坏血酸对粗柄羊肚菌菌丝生长具有明显抑制作用，对菌核发生的抑制作用更加显著。该结果与立枯丝核菌、小核盘菌和齐整小核菌的研究结果一致[16-18]，也进一步验证了氧化应激诱导真菌菌核发生的假说。
试验结果表明，较大浓度的供试自由基清除剂对粗柄羊肚菌菌丝生长具有一定的抑制作用，且该抑制作用与药剂浓度正相关，浓度过大完全抑制菌丝的生长。在齐整小核菌等植病真菌的研究中，也发现类似的结果[2，10-12]。通常情况下，抗氧化剂通过形成有毒的次级自由基产物和最终稳定的副产物而清除自由基[9]。清除剂浓度越高，这些次级自由基的积累也越多，超过了真菌抗氧化机器的中和能力，因而掩盖了清除剂的抗氧化作用，最终导致真菌死亡[10，11]。该结果可用于开发新型杀真菌剂，较高浓度的自由基清除剂可强烈抑制真菌菌丝生长，打破真菌的生活史。
CYM平板添加较强自由基清除剂(如苯甲酸钠、N，N-二甲基对亚硝基苯胺、3种巯基化合物和抗坏血酸)会改变粗柄羊肚菌菌落的颜色。羊肚菌菌落颜色的改变是真菌正常生理活动被打破的信号，是自由基清除剂保护性抗氧化应答的表现(色素也具有抗氧化作用)。
与核盘菌等多种植病真菌不同，羊肚菌的菌核没有明显分化，因此可称之为“假菌核”(Pseudosclerotium)。虽然为假菌核，但其发育过程与真菌核相似。菌核形成时，菌丝重复分枝，细胞膨大，细胞壁加厚，邻近小菌核聚结和产生色素[3-6]。本研究表明，与核盘菌、齐整小核菌等多种植物病原真菌相似，氧化应激也诱导粗柄羊肚菌菌核的发生，暗示羊肚菌菌核发育的生理学机制与其他真菌相似，可借鉴其研究成果。进一步测定不同生理状态菌株的TRS分子成分、凋亡或坏死相关的小片段DNA以及主要ROS成分、超氧化物自由基的变化，有助于深入理解羊肚菌菌核发育的生理学机制。采用比较转录组学技术结合基因功能分析，深入研究羊肚菌菌核发育的分子机制，将会有效地促进羊肚菌人工栽培驯化的发展。
参考文献：
[1] HALLIWELL B. Biochemistry of oxidative stress[J].Biochemical Society Transactions，2007，35(5)：1147-1150. [2] GEORGIOU C D， PATSOUKIS N， PAPAPOSTOLOU L，et al. Sclerotial metamorphosis in filamentous fungi is induced by oxidative stress[J]. Integrative and Comparative Biology，2006， 46 (6)： 691-712.
[3] 李 华，包海鹰，李 玉.羊肚菌研究进展[J].菌物研究，2004，2(4)：53-60.
[4] PILZ D， MCLAIN R，ALEXANDER S，et al. Ecology and Management of Morels Harvested from the Forests of Western North America[R]. Pacific Northwest Research Station， General Technical Report PNW-GTR-710， 2007.
[5] OWER R D. Notes on the development of the morel ascocarp： Morchella esculenta[J]. Mycologia，1982，74：142-144.
《《福建农业》编辑部投稿氧化应激对粗柄羊肚菌菌丝生长和菌核发生的影响》
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